方法学验证指导原则8篇

方法学验证指导原则8篇方法学验证指导原则　注释：红色带中间横线的文字表示在2020版药典删除了的2015版内容；蓝色字表示2020版药典新增加的。　9101　药品质量标准分析方下面是小编为大家整理的方法学验证指导原则8篇,供大家参考。

篇一：方法学验证指导原则

　9101

　药品质量标准分析方法验证指导原则 药品质量标准分析方法验证（analytical method validation）的目的是证明采用建立的方法适合于相应检测要求。在建立药品质量标准时，分析方法需经验证；在药品生产工艺变更、制剂的组分变更、原分析方法进行修订时，则质量标准分析方法也需进行验证。在建立药品质量标准、变更药品生产工艺或制剂组分、修订原分析方法时，需对分析方法进行验证。方法验证的理由、过程和结果均应记载在药品质量标准起草说明或修订说明中。生物制品质量控制中采用的方法包括理化分析方法和生物学测定方法，其中理化分析方法的验证原则与化学药品基本相同，所以可参照本指导原则进行，但在进行具体验证时还需要结合生物制品的特点考虑；相对于理化分析方法而言，生物学测定方法存在更多的影响因素，因此本指导原则不涉及生物学测定方法验证的内容。

　验证的分析项目有：鉴别试验、限量或定量检查、原料药或制剂中有效成分含量测定，以及制剂中其他成分（如防腐剂等，中药中其他残留物、添加剂等）的测定。药品溶出度、释放度等检查中，其溶出量等的测定方法也应进行必要验证。鉴别试验、杂质测定（限度或定量分析）、含量测定（包括特性参数和含量/效价测定，其中特性参数如：药物溶出度、释放度等）。

　验证的指标有：专属性、准确度、精密度（包括重复性、中间精密度和重现性）、专属性、检测限、定量限、线性、范围和耐用性。在分析方法验证中，须采用标准物质进行试验。由于分析方法具有各自的特点，并随分析对象而变化，因此需要视具体方法情况拟订验证的指标。表 1 中列出的分析项目和相应的验证指标可供参考。

　表 1 校验项目和验证指标

　 项目 内容 鉴别 杂质测定 含量测定及溶出量测定 -特性参数 -含量或效价测定 校正因子 定量 限度 专属性②

　+ + + +

　准确度 - + - + + 精密度

　重复性 - + - + +

　 中间精密度 - +①

　- +①

　+ 专属性②

　+ + + + + 检测限 - -③

　+ - - 定量限 - + - - + 线性 - + - + + 范围 - + - + + 耐用性 + + + + + ① 已有重现性验证，不需验证中间精密度。

　② 如一种方法不够专属，可用其他分析方法予以补充。

　③ 视具体情况予以验证。

　方法验证内容如下。

　三一、专属性 专属性系指在其他成分（如杂质、降解产物、辅料等）可能存在下，采用的分析方法能正确测定出被测物的能力。鉴别反应、杂质检査和含量测定方法，均应考察其专属性。如方法专属性不强，应采用一种或多种不同原理的方法予以补充。

　1.

　鉴别反应 应能区分可能共存的物质或结构相似的化合物。不含被测成分的供试品，以及结构相似或组分中的有关化合物，应均呈阴性反应。

　2.

　含量测定和杂质测定 采用的色谱法和其他分离方法，应附代表性图谱，以说明方法的专属性，并应标明各诸成分在图中的位置，色谱法中的分离度应符合要求。

　在杂质对照品可获得的情况下，对于含量测定，试样中可加入杂质或辅料，考察测定结果是否受干扰，并可与未加杂质或辅料的试样比较测定结果。对于杂质检查，也可向试样中加入一定量的杂质，考察各成分包括杂质之间能否得到分离。

　在杂质或降解产物不能获得的情况下，可将含有杂质或降解产物的试样进行测定，与另一个经验证了的方法或药典方法比较结果。也可用强光照射、高温、高湿、酸（碱）水解或氧化的方法进行加速强制破坏，以研究可能存在的降解产物和降解途径对含量测定和杂质测定的影响。含量测定方法应比对两种方法的结果，杂质检査应比对检出的杂质个数，必要时可采用光电二极管阵列检测和质谱检测，进行峰纯度检查。

　一二、准确度 准确度系指采用该所建立方法测定的结果与真实值或参考比值接近的程度，一般用回收率（%）表示。准确度应在规定的线性范围内测定试验。准确度也可由所测定的精密度、线性和专属性推算出来。

　在规定范围内，取同一浓度（相当于 100%浓度水平）的供试品，用至少测定 6 份样品的测定结果进行评价；或设计至少 3 种不同浓度，每种浓度分别制备至少 3 份供试品溶液进行测定，用至少 9 份样品的测定结果进行评价，且浓度的设定应考虑样品的浓度范围。两种方法的选定应考虑分析的目的和样品的浓度范围。（注释：本段内容从 2015 版

　5.数据要求

　移到该位置）

　1. 化学药含量测定方法的准确度 原料药采用对照品可用已知纯度的对照品或供试品进行测定，或用本法所得所测定结果与已知准确度的另一个方法测定的结果进行比较。制剂可在处方量空白辅料中，加入已知量被测物对照品进行测定。如不能得到制剂辅料的全部组分，可向待测制剂中加入已知量的被测物对照品进行测定，或用所建立方法的测定结果与已知准确度的另一种个方法测定结果进行比较。

　准确度也可由所测定的精密度、线性和专属性推算出来。

　2. 化学药杂质定量测定的准确度 可向原料药或制剂处方量空白辅料中加入已知量杂质对照品进行测定。如不能得到杂质或降解产物对照品，可用所建立的方法测定的结果与另一成熟的方法（如药典标准方法或经过验证的方法）的测定结果进行比较，如药典标准方法或经过验证的方法。在不能测得杂质或降解产物的校正因子或不能测得对主成分的相对校正因子的情况下，可用不加校正因子的主成分自身对照法主成分的校正因

　子计算杂质含量。，并应明确表明单个杂质和杂质总量相当于主成分的重量比（%）或面积比（%）。

　3. 中药化学成分测定方法的准确度 可用已知纯度的对照品进行加样回收率测定，即向已知被测成分含量的供试品中再精密加入一定量的已知纯度的被测成分对照品，依法测定。用实测值与供试品中含有量之差，除以加入对照品量计算回收率。在加样回收试验中须注意对照品的加入量与供试品中被测成分含有量之和必须在标准曲线线性范围之内；加入的对照品的量要适当，过小则引起较大的相对误差，过大则干扰成分相对减少，真实性差。

　回收率% =（C−A）B⁄×100%

　式中A为供试品所含被测成分量； B为加入对照品量； C为实测值。

　4. 校正因子的准确度 对色谱方法而言，绝对（或定量）校正因子是指单位面积的色谱峰代表的待测物质的量。待测定物质与所选定的参照物质的绝对校正因子之比，即为相对校正因子。相对校正因子计算法常应用于化学药有关物质的测定、中药材及其复方制剂中多指标成分的测定。校正因子的表示方法很多，本指导原则中的校正因子是指气相色谱法和髙效液相色谱法中的相对重量校正因子。

　相对校正因子可采用替代物（对照品）和被替代物（待测物）标准曲线斜率比值进行比较获得；采用紫外吸收检测器时，可将替代物（对照品）和被替代物（待测物）在规定波长和溶剂条件下的吸收系数比值进行比较，计算获得。

　54. 数据要求 在规定范围内，取同一浓度（相当于100%浓度水平）的供试品，用至少6份样品的测定结果进行评价；或设计3种不同浓度，每种浓度分别制备3份供试品溶液进行测定，用至少9份样品的测定结果进行评价。两种方法的选定应考虑分析的目的和样品的浓度范围。（注释：本段内容移到前面“1. 化学药含量测定方法的准确度”前）

　对于化学药，一般中间浓度加入量与所取供试品中待测定成分量之比控制在1:1 左右，建议高、中、低浓度对照品加入量与所取供试品中待测定成分量之比控制在 1.2:1，1:1，0.8:1 左右，应报告已知加入量的回收率（%），或测定结果平均值与真实值之差及其相对标准偏差或置信区间（置信度一般为 95%）；对于中药，一般中间浓度加入量与所取供试品中待测定成分量之比控制在 1:1 左右，建议高、中、低浓度对照品加入量与所取供试品中待测定成分量之比控制在 1.5:1，1:1，0.5:1 左右，应报告供试品取样量、供试品中含有量、对照品加入量、测定结果和回收率（%）计算值，以及回收率（%）的相对标准偏差（RSD%）或置信区间。对于校正因子，应报告测定方法、测定结果和 RSD%。样品中待测定成分含量和回收率限度关系可参考表 2。在基质复杂、组分含量低于 0.01%及多成分等分析中，回收率限度可适当放宽。

　表 2 样品中待测定成分含量和回收率限度

　待测定成分含量

　待测定成分质量分数

　回收率限度（%）

　（%）

　（ppm 或 ppb）

　（mg/g或μg/g）

　(g/g) 100% -- 1000mg/g 1.0 98~101 10% 100 000ppm 100mg/g 0.1 95~102 1% 10 000 ppm 10mg/g 0.01 92~105 0.1% 1000 ppm 1mg/g 0.001 90~108 0.01% 100 ppm 100μg/g 0.0001 85~110 10μg/g(ppm)0.001 10 ppm 10μg/g 0.000 01 80~115 1μg/g0.0001 1 ppm 1μg/g 0.000 001 75~120 10μg/kg(ppb) 10ppb 0.01μg/g 0.000 000 01 70~125 *此表源自 AOAC《Guidelines for Single Laboratory Validation of Chemical Methods for Dietary Supplements and Botanicals》 二三、精密度 精密度系指在规定的测定条件下，同一份均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。精密度一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。

　在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精密度称为重复性；在同一个实验室内的条件改变，如不同时间、由不同分析人员、用不同设备等测定结果之间的精密度，称为中间精密度；在不同实验室由不同分析人员测定结果之间的精密度，称为重现性。

　含量测定和杂质的定量测定应考察方法的精密度。

　1. 重复性 在规定范围内，取同一浓度（分析方法拟定的样品测定浓度，相当于100%浓度水平）的供试品，用至少测定6份的测定结果进行评价；或设计至少3种不同浓度，每种浓度分别制备至少3份供试品溶液进行测定，用至少9份样品的测定结果进行评价。采用至少9份测定结果进行评价时，浓度的设定应考虑样品的浓度范围。对于化学药，一般中间浓度加入量与所取供试品中待测定成分量之比控制在1:1左右，建议高、中、低浓度对照品加入量与所取供试品中待测定成分量之比控制在1.2:1，1:1，0.8:1左右，对于中药，一般中间浓度加入量与所取供试品中待测定成分量之比控制在1:1左右，建议高、中、低浓度对照品加入量与所取供试品中待测定成分量之比控制在1.5:1，1:1，0.5:1左右。

　2. 中间精密度 考察随机变动因素如，不同日期、不同分析人员、不同仪器对精密度的影响，应设计方案进行中间精密度试验。

　3. 重现性 国家药品质量标准采用的分析方法，应进行重现性试验，如通过不同实验室协同检验获得重现性结果。协同检验的目的、过程和重现性结果均应记载在起草说明中。应注意重现性试验所用样品质量的一致性及贮存运输中的环境对该一致性的影响，以免影响重现性试验结果。

　4. 数据要求 均应报告偏差、标准偏差、相对标准偏差或置信区间。样品中待测定成分含量和精密度RSD可接受范围参考表3（可接受范围可在给出数值0.5～2倍区间，计算公式，重复性：RSD r = C -0.15 ；重现性：RSD R

　= 2C -0.15 ，其中C为待测定成分含量）。在基质复杂、组分含量低于0.01%及多成分等分析中，精密度接受范围

　限度可适当放宽。

　表 3 样品中待测定成分的含量和与精密度 RSD 可接受范围* 待测定成分含量

　待测定成分质量分数

　重复性(RSD r %) 重现性(RSD R %) （%）

　（ppm 或 ppb）

　（mg/g或μg/g）

　(g/g) 100% -- 1000mg/g 1.0 1 2 10% 100 000ppm 100mg/g 0.1 1.5 3 1% 10 000 ppm 10mg/g 0.01 2 4 0.1% 1000 ppm 1mg/g 0.001 3 6 0.01% 100 ppm 100μg/g 0.0001 4 8 10μg/g(ppm)0.001 10 ppm 10μg/g 0.000 01 6 11 1μg/g0.0001 1 ppm 1μg/g 0.000 001 8 16 10μg/kg(ppb) 10ppb 0.01μg/g 0.000 000 01 15 32 *此表源自 AOAC《Guidelines for Single Laboratory Validation of Chemical Methods for Dietary Supplements and Botanicals》 四、检测限 检测限系指试样中被测物能被检测出的最低量。药品的鉴别试验和杂质检査方法，均应通过测试确定方法的检测限。检测限仅作为限度试验指标和定性鉴别的依据，没有定量意义。常用的方法如下。

　1. 直观法 用已知浓度的被测物，试验出能被可靠地检测出的最低浓度或量。

　2. 信噪比法 用于能显示基线噪声的分析方法，即把已知低浓度试样测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，计算出能被可靠地检测出的被测物质最低浓度或量。一般以信噪比为3:1或2:1时相应浓度或注入仪器的量确定检测限。

　3. 基于响应值标准偏差和标准曲线斜率法 按照LOD = 3.3δ/S 公式计算。式中LOD：检测限；δ：响应值的偏差；S：标准曲线的斜率。

　δ 可以通过下列方法测得：①测定空白值的标准偏差；②标准曲线的剩余标准偏差或是截距的标准偏差来代替。

　4. 数据要求 上述计算方法获得的检测限数据须用含量相近的样品进行验证。应附测定图谱，说明试验过程和检测限结果。

　五、定量限 定量限系指试样中被测物能被定量测定的最低量，其测定结果应符合准确度和精密度要求。对微量或痕量药物分析、定量测定药物杂质和降解产物时，应确定方法的定量限。常用的方法如下。

　1. 直观法 用已知浓度的被测物，试验出能被可靠地定量测定的最低浓度或量。

　2. 信噪比法 用于能显示基线噪声的分析方法，即把将已知低浓度试样测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，计算出能被可靠地定量的被测物质的最低浓度或量。一般以信噪比为10:1时相应浓度或注入仪器的量确定定量限。

　3. 基于响应值标准偏差和标准曲线斜率法

　按照LOQ = 10δ/S公式计算。式中LOQ：定量限；δ：响应值的偏差；S：标准曲线的斜率。

　δ 可以通过下列方法...

篇二：方法学验证指导原则

　目录

　1.概述 为什么要进行分析方法的验证？ 保证药品安全、有效、质量可控是药品研发和评价应遵循的基本原 则，其中，对药品迚行质量控制是保证药品安全有效的基础和前提。为 达到控制质量的目的，需要多角度、多层面来控制药品质量，也就是说 要对药品迚行多个项目测试，来全面考察药品质量。

　一般地，每一测试项目可选用丌同的分析方法，为使测试结果准确、 可靠，必须对所采用的分析方法的科学性、准确性和可行性迚行验证， 以充分表明分析方法符合测试项目的目的和要求，这就是通常所说的对 方法迚行验证。

　1.概述 为什么要进行分析方法的验证？ 方法验证的目的是判断采用的分析方法是否科学、合理，是否能有 效控制药品的内在质量。从本质上讲，方法验证就是根据检测项目的要 求，预先设置一定的验证内容，幵通过设计合理的试验来验证所采用的 分析方法能否符合检测项目的要求。

　方法验证在分析方法建立过程中具有重要的作用，幵成为质量研究 和质量控制的组成部分。只有经过验证的分析方法才能用于控制药品质 量，因此方法验证是制订质量标准的基础。

　2. 分析方法验证：正文 2.1 引言 本指导原则认论了在欧盟、日本和美国提交的新药注册申请资料 中分析方法验证这一部分需要考虑的特性。

　本指导原则丌一定涵盖在丐界其他地区的药品的注册或出口所要 求的验证。

　分析方法验证的目的是为了证明该分析方法不其预期目的相适应。

　2.2 需要验证的分析方法类型 鉴别试验 杂质定量试验 杂质限度试验 原料药或制剂中活性成分以及制剂中选定组分的含量测定 2. 分析方法验证：正文

　2.3 典型的验证参数 准确性（Accuracy）

　精密度（Precision）

　重复性（Repeatability）

　中间精密度（Intermediate Precision）

　与属性（Specificity）

　2. 分析方法验证：正文 检测限（Detection Limit）

　定量限（Quantitaion Limit）

　线性（Linearity）

　范围（Range）

　注意：

　- 表示该项目通常丌 需要评价；+ 表示 该项目需要评价； (1) 假如已评价重现 性，可丌需要再评 价中间精密度； (2) 缺乏与属性的分 析方法，应由其他 分析方法来作补充; (3) 某些情况下可能 需要；

　2.4 下列情况需要重新验证：

　原料药合成方法的改变 制剂组分的改变 分析方法的改变

　需要重新验证的程度应根据改变的情况而定，某些其他的改变可能也要求 验证。

　2. 分析方法验证：正文

　2.5 术语表 分析方法（Analytical procedure）

　分析方法指的是迚行分析的方式，应详细描述迚行每个分析试验所必 需的步骤。它包括（但丌限于）：样品、参比物、试剂的制备、仪器的 使用、标准曲线的绘制、计算公式的运用等。

　准确性（Accuracy）

　准确性指的是真实值或讣可的参考值不测量值之间的相近程度。

　准确性有时也称为真实度。

　2. 分析方法验证：正文

　2.5 术语表 与属性（Specificity）

　与属性是指在一些可能存在的组分如杂质、降解产物、基质等的存在下， 对被分析物质的准确可靠的测定。

　一种分析方法缺乏与属性时，应由其他分析方法作补充。

　与属性有以下含义：

　（1）定性鉴别 （2）纯度检查 （3）含量测定（含量或效价）

　2. 分析方法验证：正文

　2.5 术语表 精密度（Precision）

　精密度指的是规定条件下对同一均质样品多次取样迚行一系列检测结果的 一致程度（离散程度）。精密度可以从三方面考虑：重复性、中间精密度、 重现性。

　精密度考察应使用均质的、可信的样品。如果得丌到，可用人为配制的样 品或样品溶液迚行研究。

　分析方法的精密度通常以多次测量结果的 方差、 标 准 偏 差 或 变 异 系 数 表示。

　2. 分析方法验证：正文

　2.5 术语表 精密度（Precision）

　重复性（Repeatability）

　是 指在相同的操作条件下，在较短时间间隔内 的精密度。重复性也叫批内分析精密度。

　中间精密度（Intermediate Precision）是指实验室内部条件改变，如 丌同日、丌同操作人、丌同仪器等情况下的精密度。

　重现性（Reproducibility）是指丌同实验室之间的精密度（合作研究， 通常用于方法学的标准化）。

　2. 分析方法验证：正文

　2.5 术语表 检测限（Detection Limit）

　某一分析方法的检测限是指样品中的被分析物能够被检测到的最低量，但 丌一定要准确定量。

　定量限（Quantitation Limit）

　某一分析方法的定量限是指在合适的准确度和精密度下，能够定量测定样 品中被分析物的最低量。它是样品中含量低的化合物定量测定的参数，特别 适用于杂质和/或降解产物的测定。

　2. 分析方法验证：正文

　2.5 术语表 线性（Linearity）

　分析方法的线性是指在给定的范围内检测结果不样品中被分析物的浓度 （量）成比例关系的能力。

　范围（Range）

　分析方法的范围是指在样品中被分析物的较高浓度和较低浓度之间的一个 区间，幵已证实在此区间内，该方法具有合适的准确性、精密度和线性。

　耐用性（Robustness）

　分析方法的耐用性是指在故意对分析方法的参数迚行微小变化后，方法仍 能保持丌受影响的能力，用于说明方法在正常使用时的可靠性。

　2. 分析方法验证：正文

　3. 分析方法验证：方法学 3.1 引言 目的：

　对每一种分析方法中参数的验证提供指导和建议。

　申报中建立数据的表示方式。

　注意：

　在整个方法学验证中，必须采用经过完全确讣的、纯度已知的参比 物质来验证。

　参比物质的纯度要求不使用目的应一致。

　3. 分析方法验证：方法学 3.2 专属性 鉴别 通过不参比物（结构相同）比较得到阳性/阴性结果。

　通过不被测物结构相似或相关物质比较得丌到阳性结果。

　含量测定和杂质检查 色谱方法 使用具有代表性的色谱图来证明与属性（标出每一成分）

　分离度——与属性的标准 非与属性方法 使用其他支持性分析方法来辅助证明与属性

　3. 分析方法验证：方法学 3.2 专属性 非与属性方法 含量测定和杂质试验的方法是类似的：

　1）可得到杂质 用加入法； 2）得丌到杂质

　可以通过比较包含杂质或降解产物的样品的测试结 果和另一个性能良好的分析方法，如药典方法或其他有效的分析方法（单 独的方法）

　——对于含量测定，应该比较这两种结果； ——对于杂质试验，应该比较杂质的图形；

　3. 分析方法验证：方法学 3.3 线性 应该在分析方法的范围内评价线性关系。可以用指定的方法，直接证 明原料药（通过标准溶液的稀释液）的线性和/或混匀的制剂组分各自所 占的比例来证明其线性。

　线性应该可通过被测物浓度或含量的信号图作出直观评价。如果存在 线性关系，测试结果应该通过合适的统计方法来评价。

　原料药（标准储备液）/混匀的制剂组方 至少5个浓度系列 测定 采集信号 统计（线性关系或函数关系）

　3. 分析方法验证：方法学 3.4 范围 范围通常是从线性研究得出的，幵取决于分析方法预定的应用。

　通过验证分析方法提供的线性、准确度和精密度的可接受度建立范围。

　最小的规定范围 对原料药或制剂的含量测定 通常是测试浓度的80%~120% 对于含量均匀度 70%~130% 对于溶出度 规定值的±20%

　3. 分析方法验证：方法学 3.4 范围 最小的规定范围 对于杂质检查 为报告的杂质水平至所订限度的120% 对于产生毒性或无预期药理作用的杂质 制的水平相当 检测/定量限应该不杂质控 如果含量和纯度测试作为一个试验迚行，丏只有用到一个100%的 标准品，线性应该覆盖从杂质报告水平到含量分析规格的120%

　3. 分析方法验证：方法学 3.5 准确度 在含量测定中 原料药 用分析方法测定已知纯度的被测 物 将该法不另一成熟方法比较，得 到的准确度迚行统计和/或定义 从已经建立的精密度、线性和与 属性项中推导准确度 制剂 用分析方法测定已加入已知量的 待分析物的药物制剂组分的混合物 在制剂中加入已知量主药或不另 一成熟方法比较，得到的准确度迚行 统计和/或定义 从已经建立的精密度、线性和与 属性项中推导准确度

　3. 分析方法验证：方法学 3.5 准确度 在杂质的定量测定中 用已知量的杂质加入样品中（原料药/制剂）来评价准确度。

　在丌能获得某种杂质/降解产物的情况下，不采用其他方法测得的 结果比较，可以使用原料的响应值 申报数据 准确度的评价需在指定范围内至少3个浓度水平上迚行至少9次测 定，例如用总分析方法测定3个浓度，每个浓度3个重复样品

　3. 分析方法验证：方法学 3.6 精密度 重复性 在指定范围内测9次（3种浓度/每种重复3次）

　在100%的测定浓度时测6次 中间精密度 确定随机事件（日期、分析者、仪器等）对分析方法的精密度的影响 重现性 通过实验室之间试验的方式来评价 申报数据 应该给出所考察的精密度的标准偏差、相对标准偏差（变异系数）和置信 区间

　3. 分析方法验证：方法学 3.7 检测限 根据目测评价（用于仪器/非仪器）

　通过分析加入已知浓度的分析物的样品幵通过检测分析物的最小水 平来确定检测限。

　根据信噪比（只适用于表现出基线噪音的分析方法）

　信噪比的测定，是通过比较测得的已知低浓度的样品信号不空白样品 的信号，建立能够监测到被测物的最低浓度所得到的。

　已知低浓度被测物的信 号  3 或 2 空白样品的信号 1 1

　3. 分析方法验证：方法学 3.7 检测限 根据响应值的标准偏差或斜率 检测限（LoD）可以表达成：LoD = 3.3σ/S σ为响应值的标准偏差（通过空白样品测背景响应值或Y轴截距）

　S为标准曲线的斜率（通过被测物的校正曲线求得）

　申报数据 应提供检测限和用于确定检测限的方法。

　3. 分析方法验证：方法学 3.8 定量限 根据目测评价（用于仪器/非仪器）

　通过分析加入已知浓度的分析物的样品幵通过检测分析物的最小水 平来确定定量限。

　根据信噪比（只适用于表现出基线噪音的分析方法）

　信噪比的测定，是通过比较测得的已知低浓度的样品信号不空白样品 的信号，建立能够监测到被测物的最低浓度所得到的。

　已 知 低 浓 度 被 测 物 的 信号

　 10 空白样品的信号

　1

　3. 分析方法验证：方法学 3.8 定量限 根据响应值的标准偏差或斜率 定量限（LoQ）可以表达成：LoQ = 10σ/S σ为响应值的标准偏差（通过一组空白样品的分析或根据校正曲线）

　S为标准曲线的斜率（通过被测物的校正曲线求得）

　申报数据 应提供定量限和用于确定定量限的方法

　3. 分析方法验证：方法学 3.9 耐用性 对于方法参数的有意变动，分析方法应该表现为可靠稳定。

　典型例子 供试液的稳定性 提取时间 在HPLC中的典型例子 流动相pH的变化 流动相组分的变化 柱温 流速 丌同色谱柱（丌同批号/或丌同生产厂家）

　3. 分析方法验证：方法学 3.9 耐用性 在GC中的典型例子 丌同色谱柱（丌同批号/或丌同生产厂家）

　柱温 流速 如分析方法对分析参数的变化是敏感的，则该分析参数就应适当控 制或在方法中注明。耐用性的结果应该是建立一系列系统适应性参数（例 如，分辨率测试），以确保分析方法的有效性在仸何时候得到维持。

　3. 分析方法验证：方法学 3.10 系统适用性试验 是许多分析方法必丌可少的一部分。

　其概念是对分析方法和参数迚行验证以保证系统（仪器、数据工作 站和分析操作要点和分析的控制点）能在使用时作为一个整体正确运 行。

　建立的用于特定分析方法的系统适用性参数取决于要验证的方法类 型，请查阅药典以获取更多信息。

　4. 国内有关指导原则 《化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则》 2007年CDE颁布 由于生物制品和中药的特殊性，本原则主要适用于化学药品。

　本指导原则重点探认方法验证的本质，将分析方法验证的要求不所要达 到的目的结合起来迚行系统和规律性的阐述，重点阐述如何科学合理地迚行 论证方案的设计。

　本指导原则主要包括方法验证的一般原则、方法验证涉及的三个主要方 面、方法验证的具体内容、方法再验证、对方法验证的评价等内容。

　4. 国内有关指导原则 4.1 方法验证的一般原则 原则上每个检测项目采用的分析方法，均需要迚行方法验证。

　方法验证的内容应根据检测项目的要求，结合所采用分析方法的特点确定。

　同一分析方法用于丌同的检测项目会有丌同的验证要求。例如，采用高效 液相色谱法用于制剂的鉴别和杂质定量试验应迚行丌同要求的方法验证，前 者重点要求验证与属性，而后者重点要求验证与属性、准确度、定量限。

　4. 国内有关指导原则 4.2 方法验证涉及的三个主要方面 需要验证的检测项目 鉴别 杂质检查（限度试验、定量试验）

　定量测定（含量测定、溶出度、释放度等）：由于此类项目对准确性要求 较高，故所采用的分析方法要求具有一定的与属性、准确度和线性。

　其他特定检测项目：包括粒径分布、旋光度、分子量分布等

　4. 国内有关指导原则 4.2 方法验证涉及的三个主要方面 分析方法 本指导原则所指分析方法是为完成上述各检测项目而设定和建立的测试方 法，一般包括分析方法原理、仪器及仪器参数、试剂、系统适用性试验、供 试品溶液制备、对照品溶液制备、测定、计算及测试结果的报告等。

　测试方法可采用化学分析方法和仪器分析方法。这些方法各有特点，同一 测试方法可用于丌同的检测项目，但验证内容可丌相同。

　验证内容：包括方法的与属性、线性、范围、准确度、精密度、检测限、 定量限、耐用性和系统适用性等。

　4. 国内有关指导原则 4.3 方法再验证 在某些情况下，如原料药合成工艺改变、制剂处方改变、分析方法发生部 分改变等，均有必要对分析方法再次迚行全面或部分验证，以保证分析方法 可靠，这一过程称为方法再验证。

　再验证原则：根据改变的程度迚行相应的再验证。

　方法再验证是对分析方法的完善过程，应根据实际改变情况迚行再验证， 从而保证所采用的分析方法能够控制药品的内在...

篇三：方法学验证指导原则

　介绍：

　该修订指南草案将取代行业 2000 年的指导分析方法和方法验证草案，并最终确定后，也将取代 1987 年美国 FDA 行业指南《提交的样品和分析数据的方法验证》。该草案提供了有关申请人如何提交分析程序和方法验证数据来支持说明原料药和制剂具有强度、质量、纯度和效用的文件。它会帮你收集信息和现有数据来支持你的分析方法。该指导原则适用于原料药和制剂产品涵盖新药申请（NDA），简化新药申请（仿制药），生物制品许可申请（BLA），以及这些申请的补充申请。在这个修订草案指导原则也适用于原料药和制剂产品涵盖二类药物主文件（DMFs）。

　该修订指南草案补充了国际协调会议（ICH）Q2（R1）指导原则《分析程序的验证：开发和验证的分析方法 Q2（R1）和方法的文本。

　该修订指南草案不涉及研究性新药申请（IND）方法验证，但研究者在准备研究性新药申请时应考虑该指导原则中的建议。研究性新药申请需要在研究的每个阶段有足够的信息，以确保正确鉴别性，质量，纯度，强度和/或效力。对分析方法和方法验证的信息量将随研究中不同阶段而变化。有关分析程序和需提交的阶段方法验证资料方面的指导意见的研究中，申请者可以参考 FDA 的指导原则《Ⅰ期研究药物的 IND 的内容和格式，包括性状、疗效和生物技术衍生产品》。

　一般考虑在第三阶段的研究进行之前，分析方法和分析方法验证（例如，生物测定）是在 FDA 行业指导原则《人类药物和生物制剂、化学、制造、控制信息会议》。

　该修订指南草案不涉及生物和免疫化学检测的表征和许多原料药和制剂产 品质量控制的具体方法验证的建议。例如，一些基于动物模型的生物测定，并且免疫原性评估或其它免疫测定具有独特的特征，应开发和验证过程中予以考虑。

　此外，需要对现有的分析方法再验证时可能需要在制造过程中产品的生命周期的变化予以考虑。有关适当的验证方法的分析程序或者提交本指南中未提及的信息的问题，您应该向用 FDA 产品质量评审人员咨询。

　如果您选择了与本指导草案中不同的方式，我们建议您在提交申请前与相应的 FDA 产品质量评审人员讨论。

　FDA 的指南文件，包括本指导原则，不具有法律强制性的责任。相反，指南描述的是 FDA 对某个主题目前的想法，并应仅作为建议，除非有明确的法律或法规要求的引用。使用“应该”这个词在 FDA 指南意味着什么建议或推荐，但不是必需的。

　II. BACKGROUND 背景 每个 NDA 和 ANDA 都必需包括必要的分析程序，以确保原料药和制剂的鉴别，强度，质量，纯度和效果.每个 BLA 必须包括完整的制造方法描述，包括能够确保产品身份、质量、安全、纯度和有效的分析程序。数据必须能够用于建立满足精度和可靠性标准的分析方法并适合与拟定目的.对于 BLAs 及补充补充，分析方法和方法验证是许可证申请或补充申请必须提交的一部分，并通过美国 FDA 质量评审小组进行评估。

　分析方法和验证资料应当按照 ICH M2 eCTD 的相应部分提交。

　当一个分析程序作为 NDA，ANDA 或者 BLA 的一部分被批准时，它就变成了 FDA 获批药品

　的获批分析程序。这个分析程序可能源于 FDA 认可来源（如源于 USP/NF 的药店程序）或者是一个提交的已被认定通过美国 FDA 可以接受的经验证的程序。应用一个分析方法到不同的产品，需要考虑对新产品进行适当的验证研究。

　III. ANALYTICAL METHODS DEVELOPMENT 分析方法开发 分析方法的开发是为了一个定义药物原料药与制剂产品特性的检测标准。

　新方法开发初期，应当基于分析项目与方法适用范围选择检测仪器和检测方法。该方法可在开发过程中进行专属性，线性，检测限（LOD）和定量限（LOQ），范围，精度和准确度的评估。

　在方法开发过程的早期阶段，方法的稳定性应进行评估，因为这个特性可以帮助您确定哪一种方法您将提交审批。在发展的早期阶段分析程序最初开发基于基本方法和以往的经验机理认识的结合。早期程序的实验数据可用于指导进一步发展。你应该在方法验证部分中提交支持该方法的有效性的发展数据。

　要充分认识在变化在分析过程方法参数的影响，你应该采取的方法的稳定性研究（例如，实验方法参数设计）的系统方法。你应该从风险评估开始，并跟进多因素实验。这些方法能让你了解到方法性能参数因子的影响。检测方法的性能评价贯穿了样品生产的整个过程。在研究专属性过程中获得的知识可以帮助你评估方法的性能。

　IV. CONTENT OF ANALYTICAL PROCEDURES 分析程序内容 你应该说明分析过程中足够的细节，让主管分析师重现的必要条件，并提出验收标准范围内得到结果。您还应该说明需要特别注意的分析程序问题。如果所参考的分析方法未经过修改超出了已发布方法的允许，需引用 FDA 认可的来源（如：USP

　/ NF，分析师协会（AOAC）国际）。你应提供详细的从其他出版来源的程序。以下是重要的信息，你应该包括一个分析程序的列表：

　A. 原则/范围 分析测试/技术（分离，检测等）的基本原理的说明;目标分析物和样品（S）型（如，药物，药品，生物体液等杂质或化合物）。

　B. 仪器/设备 所有需要的合格的设备和部件（例如，仪器类型，检测器，柱子类型，尺寸，过滤器类型等）。

　C. 操作参数 合格的最佳设置和范围（可予以调整）对分析至关重要（比如，流速，组件的温度，运行时间，顶空进样器、检测器的设置）。如果适用实验配置和集成参数的绘图也可以使用。

　D.

　试剂/标准 以下应列出：

　 •化学的等级（例如，USP / NF，美国化学学会，高效液相色谱级，或气相色谱级）。

　 •来源（例如，参照美国药典标准或合格的内部参考材料）。

　 •状态（例如，干燥，未干燥等）及浓度。

　•标准纯度（纯度校正因子）。

　•存储控制。

　•安全使用说明书（按目前的安全数据）。

　 •验证或可用的保质期。

　生物试剂，如单克隆抗体，多克隆抗体，或细胞，资格审查程序中队新的批次有一定的资格限制。

　E.

　样品制备

　 样品制备过程（例如，萃取法，稀释或浓缩，混合超声脱盐过程，振摇或超声处理的时间等）

　单方和复方检测时的溶解浓度 （如，微克/毫升或毫克/毫升），以及溶液储存的稳定性信息。

　F.

　标准对照品溶液的制备

　所有标准对照品溶液的配制方法和储存条件，包括校准标准，内部标准，系统适用性标准等。

　G.

　程序

　 一步一步的描述分析方法（例如，平衡时间，空白对照，安慰剂，样本，控制，灵敏度溶液（杂质的方法）和样品分析的系统适用性），以及工作范围的调整。

　H.

　系统适用性

　 确证试验（次）的程序和参数，以确保系统（分析设备，电子及操作）将作为一个系统在使用的时候正常工作。适用于标准和控制，如峰拖尾，精密度和分离度。对于色谱系统的系统适用性，是指在色谱方法的验证和 USP 通则<621>色谱评审指导。

　I.

　计算

　 用于基于标签要求和测试（例如，检测，指定和非指定杂质和相对影响因子）的积分方法和有代表性的计算公式进行数据分析（标准品，质控，样品）。这包括用于数据分析的数学转换或公式的描述，以及使用一个科学的校正因子。

　J.

　数据报告

　 一个演示数字数据是与仪器的功能和验收标准是一致的。该方法应说明什么格式来与所需显著数字的具体数量报告结果（例如，百分比标签要求，重量/体重，重量/体积等）。在美国测试和材料协会（ASTM）E29 描述了使用显著位数的测试数据，以确定是否符合规范的标准做法。对于色谱方法，你应该包括保留时间（RT）识别与参考标准比较的基础上，相对保留时间（RRTS）（已知和未知杂质）可接受的范围和样本结果报告标准。

　V. 参考标准和教材 一级和二级参考标准和材料的定义，并讨论以下 ICH 指导原则：Q6A 规格：新原料药和新制剂的测试程序和验收标准：化学原料（

　ICH Q6A

　）

　，Q6B 规格：生物技术/生物制品的测试程序和验收标准，活性药物成分和 Q7 优良制造规范指南。对于所有的标准，应该确保适用性。原料药的标准建立中验证专属性的鉴别试验尤为关键，要严格按照存储，使用条件的参考标准操作，以避免增加杂质导致分析处理不准确。对于生物制品，应当包括支持您打算在以后的年度报告参考的参考标准资格和材料的信息。支持参考标准和材料包括鉴定试验方案，报告和分析证书（如果可以，应包括协议和相关的已知杂质的信息）。

　参考标准通常可以从美国专利获得，也可以通过欧洲药典，日本药典，世界卫生组织，或标准和技术研究所提供。我们可以从美国药品与生物制品中心找到关于生物制品的参考标准。对于在美国销售的生物制品，在上市之前必须参考美国药品与生物制品中心的标准。其他来源的参考资料，必须以 ICH Q6A 常规与非常规测试结果为参考。你应该考虑正交方法，进一步的测试可以包括材料的属性来确定其适应性（例如，更广泛的结构同一性和纯度和杂质的正交技术，生物活性）。

　对于生物参考标准和材料，我们建议您遵循两个层次的方法检验的新参考标准，可以帮助防止不稳定的质量属性，并提供长期的链接，临床试验材料。一个两层的方法涉及用一个基本参考标准与每个新的工作参照标准进行比较， 因此它是临床试验材料和当前的制造工艺的链接。

　VI.

　分析方法验证用于新药，仿制药，生物制品，和药物主文件

　 A.非药典分析方法

　 分析方法验证是论证某一分析方法适用于其预期目的的过程。分析程序的方法和目标应明确界定，并启动明确的验证研究。这种方法是以科学为基础的方法开发和优化研究中获得。

　验证数据产生于被证实的草案中对生产实践所采取的特征性试验方法、合理的验收标准、规范的仪器操作。该关于药物原料、制剂分析及复方制剂分析的协议应当根据各自的特性执行并完善。ICH Q2（R1）被认为是对分析方法验证的特性建议和定义主参考。美国食品药物管理局审稿指南：色谱方法的验证是可用的。

　B.验证特性

　 虽然不是所有的验证特性适用于所有类型的测试，验证的典型特征是：

　•专属性 •线性 •准确度 •精确度（重复性，中间精密度和重现）

　•范围 •定量限 •检测限 稳定性指示分析即为一个定量分析方法的程序，可以检测出在储存过程中的药物物质和药物产品的质量属性（S）的变化。表现出稳定性指示测定的特异性，应进行干扰实验。包括使用的样品加入标靶分析物和所有已知的干扰杂质，实验室试制样本， 和实际产品样本（由最终制造过程生产的）， 或者是加速试验样品。作为新药、仿制药、生物制品的申请者，则必须：（1）提交用于建立该分析方法的符合精度和可靠性的适当标准的检测数据。（2）通知FDA 的在申请成立以后的每个修改，包括对分析程序、控制变化的应用程序及方法等。所提交的数据应包括从该方法的开发到方法验证研究的稳定性数据。

　C.药典分析方法 某一分析方法的适用性（如 USP / NF，AOAC 国际方法学图书，或其他认可的参考标准）应在实际使用条件下进行验证。药典一般章节会比较复杂，为了达到预期使用和验证目的，应当将多个步骤、地址或多种技术合理化。证明 USP / NF 分析方法适用于该药品或原料药的信息应包括在提交的验证协议里。

　验证方法应该包括，但不限于：药典方法中以预定的验收标准进行验证，并且该方法的详细信息（例如，多个试剂的适用性，设备，组件，色谱条件，色谱柱，检测器类型，检测器信号响应，系统适应性，样品制备和稳定性）。验证方法应包括验证范围和规定了验证特性的测试（例如，特异性，检测限，定量限，精密度，准确度等）。因为药物在不同的合成路线均有严格的设置，药品制造过程中分析方法有色谱条件改变的情况。如果按照法无偏差，稳定性研究不需要被药典收录。

　VII. 统计分析和模型 A.统计 预定的验收标准验证特征可用验证数据的统计分析进行评估。在数据分析中使用的所有的统计方法和参数应根据合理的原则和恰当的预期评估。线性回归分析 R（相关系数）呈报的统计数据中应该提供 R 平方（决定系数），最小二乘法，方差分析，置信区间等。有关对比用的统计技术的信息，以及有关分析数据，相关文献或文本的解释应进行讨论。

　B.模型 一些分析方法可能使用化学计量学和/或多元模式。在开发这些模型时，应该包括在统计上足够数量的模型开发样本和可比样本进行模型范围的验证。合适的软件应被用于数据分析。模型的参数应该随之改变来测试模型的稳定性。

　VIII. 分析程序生命周期管理 一旦分析过程（包括药典方法）被成功地验证和实施，该过程将在产品的整个生命周期遵循。方法的性能趋势分析应定期进行，以评估是否需要进行优化分析程序或对分析过程的整体或部分进行重新验证。如果某一分析方法在分析方法中规定的使用条件下反复调整，才能满足建立了系统适用性的要求，则该分析方法应重新评估、验证或修订。

　在一个产品的生命周期，新的信息（例如，更好地了解产品或新杂质）可保证一个新的或其他分析方法的开发和验证。保证产品质量时，新的技术应给与更多的鼓励和信心。申请人应

　定期评估对产品的分析方法是否恰当，并考虑新的或替代方法。

　在分析生命周期的变化时，应当对样品进行适当数量的存档，以便进行比较研究。留样数量应根据科学原理和风险评估确定。对于那些生产过程中敏感且易产生复杂变化的产品，留样样品是作对比的重要工具。在比较研究中使用的留样样品应包括具有代表性的临床试验材料样品和销售产品。

　如果一个基于风险的评估或...

篇四：方法学验证指导原则

　范围 准确测定生物基质（如全血、 血清、 血浆、 尿）

　中的药物浓度， 对于药物和制剂研发非常重要。

　这些数据可被用于支持药品的安全性和有效性， 或根据毒动学、 药动学和生物等效性试验的结果做出关键性决定。

　因此， 必须完整地验证和记录应用的生物分析方法， 以获得可靠的结果。

　本指导原则提供生物分析方法验证的要求， 也涉及非临床或临床试验样品实际分析的基本要求， 以及何时可以使用部分验证或交叉验证， 来替代完整验证。

　生物样品定量分析方法验证和试验样品分析应符合本指导原则的技术要求。应该在相应的生物样品分析中遵守 GLP 原则或 GCP 原则。

　2.

　生物分析方法验证 2. 1 分析方法的完整验证 分析方法验证的主要目的是， 证明特定方法对于测定在某种生物基质中分析物浓度的可靠性。

　此外， 方法验证应采用与试验样品相同的抗凝剂。

　一般应对每个物种和每种基质进行完整验证。

　当难于获得相同的基质时， 可以采用适当基质替代， 但要说明理由。

　一个生物分析方法的主要特征包括：

　选择性、 定量下限、 响应函数和校正范围（标准曲线性能）、 准确度、 精密度、 基质效应、 分析物在生物基质以及溶液中储存和处理全过程中的稳定性。

　有时可能需要测定多个分析物。

　这可能涉及两种不同的药物， 也可能涉及一个母体药物及其代谢物， 或一个药物的对映体或异构体。

　在这些情况下， 验证和分析的原则适用于所有涉及的分析物。

　对照标准物质 在方法验证中， 含有分析物对照标准物质的溶液将被加入到空白生物基质中。

　此外， 色谱方法通常使用适当的内标。

　应该从可追溯的来源获得对照标准物质。

　应该科学论证对照标准物质的适用性。

　分析证书应该确认对照标准物质的纯度， 并提供储存条件、 失效日期和批号。对于内标， 只要能证明其适用性即可， 例如显示该物质本身或其相关的任何杂质不产生干扰。

　当在生物分析方法中使用质谱检测时， 推荐尽可能使用稳定同位素标记的内标。

　它们必须具有足够高的同位素纯度， 并且不发生同位素交换反应， 以避免结果的偏差。

　 22. 1. 1 选择性 该分析方法应该能够区分目 标分析物和内标与基质的内源性组分或样品中其他组分。

　应该使用至少 6 个来源的适宜的空白基质来证明选择性， 它们被分别分析并评价干扰。

　当干扰组分的响应低于分析物定量下限响应的 20%， 并低于内标响应的 5%时， 通常即可以接受。

　应该考察药物代谢物经样品预处理生成的分解产物以及可能的同服药物引起干扰的程度。

　应该考虑通常用于受试者群体试验的同服药物。

　在适当情况下，也应该评价代谢物在分析过程中回复转化为母体分析物的可能性。

　2. 1. 2 残留 应该在方法建立中考察残留并使之最小。

　残留可能不影响准确度和精密度。应通过在注射高浓度样品或校正标样后， 注射空白样品来估计残留。

　高浓度样品之后在空白样品中的残留应不超过定量下限的 20%， 并且不超过内标的 5%。

　应考虑特殊措施， 在方法验证时检验并在试验样品分析时应用这些措施， 以确保不影响准确度和精密度。

　这可能包括在高浓度样品后注射空白样品， 然后分析下一个试验样品。

　2. 1. 3 定量下限 定量下限是能够被可靠定量的样品中分析物的最低浓度， 具有可接受的准确度和精密度。

　定量下限是标准曲线的最低点， 应适用于预期的浓度和试验目的。

　2. 1. 4 标准曲线 应该在指定的浓度范围内评价仪器对分析物的响应， 获得标准曲线。

　通过加入已知浓度的分析物（和内标）

　到空白基质中， 制备各浓度的校正标样， 其基质应该与目标试验样品基质相同。

　方法验证中研究的每种分析物和每一分析批， 都应该有一条标准曲线。

　在进行分析方法验证之前， 最好应该了解预期的浓度范围。

　标准曲线范围应该尽量覆盖预期浓度范围， 由定量下限和定量上限（校正标样的最高浓度）

　来决定。

　该范围应该足够描述分析物的药动学。

　应该使用至少 6 个校正浓度水平， 不包括空白样品（不含分析物和内标的处理过的基质样品）

　和零浓度样品（含内标的处理过的基质）。

　每个校正标样可以被重复分析。

　应该使用简单且足够描述仪器对分析物浓度响应的关系式。

　空白和零浓度样品结果不应参与计算标准曲线参数。

　应该提交标准曲线参数， 测定校正标样后回算得出的浓度应一并提交。

　在方法验证中， 至少应该评价 3 条标准曲线。

　 3校正标样回算的浓度一般应该在标示值的±15%以内， 定量下限处应该在±20%内。

　至少 75%校正标样， 含最少 6 个有效浓度， 应满足上述标准。

　如果某个校正标样结果不符合这些标准， 应该拒绝这一标样， 不含这一标样的标准曲线应被重新评价， 包括回归分析。

　最好使用新鲜配制的样品建立标准曲线， 但如果有稳定性数据支持， 也可以使用预先配制并储存的校正标样。

　2. 1. 5 准确度 分析方法的准确度描述该方法测得值与分析物标示浓度的接近程度， 表示为：

　（测得值/真实值）

　× 100%。

　应采用加入已知量分析物的样品来评估准确度，即质控样品。

　质控样品的配制应该与校正标样分开进行， 使用另行配制的储备液。

　应该根据标准曲线分析质控样品， 将获得的浓度与标示浓度对比。

　准确度应报告为标示值的百分比。

　应通过单一分析批（批内准确度）

　和不同分析批（批间准确度）

　获得质控样品值来评价准确度。

　为评价一个分析批中不同时间的任何趋势， 推荐以质控样品分析批来证明准确度， 其样品数不少于一个分析批预期的样品数。

　批内准确度 为了验证批内准确度， 应取一个分析批的定量下限及低、 中、 高浓度质控样品， 每个浓度至少用 5 个样品。

　浓度水平覆盖标准曲线范围：

　定量下限， 在不高于定量下限浓度 3 倍的低浓度质控样品， 标准曲线范围中部附近的中浓度质控样品， 以及标准曲线范围上限约 75%处的高浓度质控样品。

　准确度均值一般应在质控样品标示值的±15%之内， 定量下限准确度应在标示值的±20%范围内。

　批间准确度 通过至少 3 个分析批， 且至少两天进行， 每批用定量下限以及低、 中、 高浓度质控样品， 每个浓度至少 5 个测定值来评价。

　准确度均值一般应在质控样品标示值的±15%范围内， 对于定量下限， 应在标示值的±20%范围内。

　报告的准确度和精密度的验证数据应该包括所有获得的测定结果， 但是已经记录明显失误的情况除外。

　2. 1. 6 精密度 分析方法的精密度描述分析物重复测定的接近程度， 定义为测量值的相对标准差（变异系数）。

　应使用与证明准确度相同分析批样品的结果， 获得在同一批内和不同批间定量下限以及低、 中、 高浓度质控样品的精密度。

　对于验证批内精密度， 至少需要一个分析批的 4 个浓度， 即定量下限以及低、中、 高浓度， 每个浓度至少 5 个样品。

　对于质控样品， 批内变异系数一般不得超过 15%， 定量下限的变异系数不得超过 20%。

　 4对于验证批间精密度， 至少需要 3 个分析批 （至少 2 天）

　的定量下限以及低、中、 高浓度， 每个浓度至少 5 个样品。

　对于质控样品， 批间变异系数一般不得超过 15%， 定量下限的变异系数不得超过 20%。

　2. 1. 7 稀释可靠性 样品稀释不应影响准确度和精密度。

　应该通过向基质中加入分析物至高于定量上限浓度， 并用空白基质稀释该样品（每个稀释因子至少 5 个测定值）， 来证明稀释的可靠性。

　准确度和精密度应在±15%之内， 稀释的可靠性应该覆盖试验样品所用的稀释倍数。

　可以通过部分方法验证来评价稀释可靠性。

　如果能够证明其他基质不影响精密度和准确度， 也可以接受其使用。

　2. 1. 8 基质效应 当采用质谱方法时， 应该考察基质效应。

　使用至少 6 批来自不同供体的空白基质， 不应使用合并的基质。

　如果基质难以获得， 则使用少于 6 批基质， 但应该说明理由。

　对于每批基质， 应该通过计算基质存在下的峰面积（由空白基质提取后加入分析物和内标测得）， 与不含基质的相应峰面积（分析物和内标的纯溶液）

　比值，计算每一分析物和内标的基质因子。

　进一步通过分析物的基质因子除以内标的基质因子， 计算经内标归一化的基质因子。

　从 6 批基质计算的内标归一化的基质因子的变异系数不得大于 15%。

　该测定应分别在低浓度和高浓度下进行。

　如果不能适用上述方式， 例如采用在线样品预处理的情况， 则应该通过分析至少 6 批基质， 分别加入高浓度和低浓度（定量下限浓度 3 倍以内以及接近定量上限）， 来获得批间响应的变异。

　其验证报告应包括分析物和内标的峰面积， 以及每一样品的计算浓度。

　这些浓度计算值的总体变异系数不得大于 15%。

　除正常基质外， 还应关注其他样品的基质效应， 例如溶血的或高血脂的血浆样品等。

　2. 1. 9 稳定性 必须在分析方法的每一步骤确保稳定性， 用于检查稳定性的条件， 例如样品基质、 抗凝剂、 容器材料、 储存和分析条件， 都应该与实际试验样品的条件相似。用文献报道的数据证明稳定性是不够的。

　采用低和高浓度质控样品 （空白基质加入分析物至定量下限浓度 3 倍以内以及接近定量上限）， 在预处理后以及在所评价的条件储存后立即分析。

　由新鲜制备的校正标样获得标准曲线， 根据标准曲线分析质控样品， 将测得浓度与标示浓度相比较， 每一浓度的均值与标示浓度的偏差应在±15%范围内。

　 5应通过适当稀释， 考虑到检测器的线性和测定范围， 检验储备液和工作溶液的稳定性。

　稳定性检查应考察不同储存条件， 时间尺度应不小于试验样品储存的时间。

　通常应该进行下列稳定性考察：

　 分析物和内标的储备液和工作溶液的稳定性；

　 从冰箱储存条件到室温或样品处理温度， 基质中分析物的冷冻和融化稳定性；

　 基质中分析物在冰箱储存的长期稳定性；

　此外， 如果适用， 也应该进行下列考察：

　 处理过的样品在室温下或在试验过程储存条件下的稳定性；

　 处理过的样品在自动进样器温度下的稳定性。

　在多个分析物试验中， 特别是对于生物等效性试验， 应该关注每个分析物在含所有分析物基质中的稳定性。

　应特别关注受试者采血时， 以及在储存前预处理的基质中分析物的稳定性，以确保由分析方法获得的浓度反映受试者采样时刻的分析物浓度。

　可能需要根据分析物的结构， 按具体情况证明其稳定性。

　2. 2 部分验证 在对已被验证的分析方法进行小幅改变情况下， 根据改变的实质内容， 可能需要部分方法验证。

　可能的改变包括：

　生物分析方法转移到另一个实验室， 改变仪器、 校正浓度范围、 样品体积， 其他基质或物种， 改变抗凝剂、 样品处理步骤、储存条件等。

　应报告所有的改变， 并对重新验证或部分验证的范围说明理由。

　2. 3 交叉验证 应用不同方法从一项或多项试验获得数据， 或者应用同一方法从不同试验地点获得数据时， 需要互相比较这些数据时， 需要进行分析方法的交叉验证。

　如果可能， 应在试验样品被分析之前进行交叉验证， 同一系列质控样品或试验样品应被两种分析方法测定。

　对于质控样品， 不同方法获得的平均准确度应在±15%范围内， 如果放宽， 应该说明理由。

　对于试验样品， 至少 67%样品测得的两组数值差异应在两者均值的±20%范围内。

　3.

　试验样品分析 在分析方法验证后， 可以进行试验样品或受试者样品分析。

　需要在试验样品分析开始前证实生物分析方法的效能。

　应根据已验证的分析方法处理试验样品以及质控样品和校正标样， 以保证分析批被接受。

　 63. 1 分析批 一个分析批包括空白样品和零浓度样品， 包括至少 6 个浓度水平的校正标样， 至少 3 个浓度水平质控样品（低、 中、 高浓度双重样品， 或至少试验样品总数的 5%， 两者中取数目更多者）， 以及被分析的试验样品。

　所有样品（校正标样、质控和试验样品）

　应按照它们将被分析的顺序， 在同一样品批中被处理和提取。一个分析批包括的样品在同一时间处理， 即没有时间间隔， 由同一分析者相继处理， 使用相同的试剂， 保持一致的条件。

　质控样品应该分散到整个批中， 以此保证整个分析批的准确度和精密度。

　对于生物等效性试验， 建议一名受试者的全部样品在同一分析批中分析， 以减少结果的变异。

　3. 2 分析批的接受标准 应在分析试验计划或标准操作规程中， 规定接受或拒绝一个分析批的标准。在整个分析批包含多个部分批次的情况， 应该针对整个分析批， 也应该针对分析批中每一部分批次样品定义接受标准。

　应该使用下列接受标准：

　校正标样测定回算浓度一般应在标示值的±15%范围内， 定量下限应在±20%范围内。

　不少于 6 个校正标样， 至少 75%标样应符合这些标准。

　如果校正标样中有一个不符合标准， 则应该拒绝这个标样， 重新计算不含该标样的标准曲线， 并进行回归分析。

　质控样品的准确度值应该在标示值的±15%范围内。

　至少 67%质控样品， 且每一浓度水平至少 50%样品应符合这一标准。

　在不满足这些标准的情况下， 应该拒绝该分析批， 相应的试验样品应该重新提取和分析。

　在同时测定几个分析物的情况下， 对每个分析物都要有一条标准曲线。

　如果一个分析批对于一个分析物可以接受， 而对于另一个分析物不能接受， 则接受的分析物数据可以被使用， 但应该重新提取和分析样品， 测定被拒绝的分析物。

　如果使用多重校正标样， 其中仅一个定量下限或定量上限标样不合格， 则校正范围不变。

　所有接受的分析批， 每个浓度质控样品的平均准确度和精密度应该列表， 并在分析报告中给出。

　如果总平均准确度和精密度超过 15%， 则需要进行额外...

篇五：方法学验证指导原则

　内容提要：

　（方法学验证的应用、 依据、 类型、 一般参数、 要求）

　验证应用：

　方法验证是对测定方法的评价， 是建立新方法的研究内容和依据。

　（新建方法、 已建立方法的修订验证、 已建方法的复现）

　验证依据：

　方法应用领域对方法验证要求的“指导原则”

　验证类型：

　全部验证 Fall validation、 部分验证 Partial validation、 交叉验证 cross validation

　 

　 Full validation：

　第一次新建方法； 一个已建方法， 但增加分析对象（精密、 回收）

　。

　

　 Partial validation：

　（已建方法的部分改变）

　1)

　分析方法改变（检测器改变）

　；

　2)

　生物样品（抗凝剂改变）

　；

　3)

　基质改变（血－尿）

　；

　4)

　前处理方法改变；

　5)

　生物样品种属改变（rat 大鼠－mouse 小鼠）

　；

　6)

　仪器改变工作软件改变；

　7)

　稀有生物样品， 取样量有限。

　

　 Cross validation：

　样品分析在不同场所或实验室进行时， 不同实验室需进行加样生物样品或实际样品分析， 建立实验室间的重现性数据。

　当分析数据由不同检测技术产生时 LC－MS vs ELSD 需交叉验证

　 部分验证：

　准确度， 精密度（都做）

　交叉验证：

　加样准确度， 实际样品分析（任一）

　一般参数：

　精密度 precision: 同一匀质样品的一组测量值， 彼此符合的程度。

　1)

　SD 标准偏差 standard deviation 2)

　％RSD 相对标准偏差 relative SD，

　CV 变异系数

　n>8 标准差 SD=开方（求和（xi－x 均值）

　/（n－1）

　）

　％RSD＝SD/x 均值×100％ 

　 日内精密度（intraday precision）

　：

　同一次测定， 7～10 份， 按方法做。

　测定， SD 值， RSD限度（生物制品 5％， 药品 2％）

　。

　

　 日间精密度（interday precision）

　：

　不同一次测定， 7～10 份， 按方法做。

　测定， SD 值， RSD限度（生物制品 15％， 药品 5％）

　。

　准确性 accuracy：

　

　 结果与真值的接近程度， 表示分析方法测定的正确性， 通常用回收率实验表示 （加样回收率）。

　

　 回收率＝（测定液测定值－原样液含测值）

　/加入量值×100％

　 灵敏度：

　

　 检测限（limit of detection LOD）

　：

　分析方法能从背景信号中区分出药物， 所需样品中药物的最低浓度， LOD 反映方法与仪器的灵敏度和噪音也表明样品经处理后本底值的高低。S/N>3 

　 定量限（limit of quantitation LOQ）

　在保证具有一定可靠性（一定准确度和精密度）

　分析方法能够测定出样品中药物的最低浓度。

　反映分析方法测定含药物的低浓度样品时的可靠性。

　选择性（selectivity）

　：

　分析方法从其他成分中区分并定量目标成分的能力 

　 专属性（specificity）

　：

　指一种方法仅对一种分析成分产生唯一信号 

　 选择性（selectivity）

　：

　指一种方法可对多种成分产生不同响应， 主要成分响应可与其他成分区分 选择性的区分选择内容：

　

　 化药：

　杂质、 降解产物、 相关化合物、 制剂辅料（可通过空白比较和添加法所得分析结果比较确定）

　

　 体内药物：

　内源性物质、 代谢物、 分解产物、 分析中的相伴物、 内源性代谢物 

　 体内药分的选择性内容：

　空白生物样品（血尿、 胆汁等）

　、 至少六个来源的生物样品（非MS 方法）

　、 每个空白样品均测定干扰和 LOQ。

　线性（liner）

　：

　

　 给定范围内获取与样品中供试物浓度成正比的试验结果的能力 

　 线性范围是指利用一种方法取得精密度、 准确度均符合要求的试验结果， 而且呈线性的供试物浓度的变化范围其最大、 最小量间的间隔。

　

　 浓度范围包括 5-8 个浓度点， 标准曲线应覆盖样品浓度范围。

　1.

　 药物一般 80-120%（但低限不低于 LOQ）

　2.

　 体内药物、 浓度上线高于样品最高浓度， 下限为 LOQ 3.

　 相关系数(r) 表示了 线性度 r≧ 0.9900

　 重现性（Repeatibility）

　相同方法在正常条件下多次重复测定同一匀质样品所得分析结果的重现程度。

　稳定性（Stability）

　

　 生物样品中药物的稳定性涉及储存条件、 药物理化性质、 基质、 容器系统。

　

　 Stability 评价包括：

　样品收集与前处理、 短期储存、 长期储存、 冻融、 处理后稳定性。

　稳定性试验要求 

　 Stability 考察条件应反映实际测定过程的实验条件。

　

　 应包括 Stocking solution 稳定性的考察 

　 冻融稳定性至少高、 中、 低三个浓度、 三个冻融过程 在真实实验条件下保存样品， 室温化冻， 至少保存 24 小时， 第二、 三次相同条件下至少保存 12-24 小时， 在第三个 circle 时分析。

　

　 如果样品不稳定， 应在-70℃下保存 

　 短期稳定性：

　样品化冻后室温 4-24 小时 考察稳定性 

　 长期稳定性：

　应包括第一样品—>最后样品分析结束的全过程（三个浓度、 足够样品）

　

　 处理后稳定性

　 分析过程 ~~~ 一个方法经建立、 验证、 正常应用后进行分析。

　分析包括：

　标准溶液配制、 分析法与过程建立、 验证后方法应用与建立分析结果认可的标准。

　药物定量方法：

　LC、 GC、 生化免疫、 同位素标示。

　验证要求：

　1.

　 标准曲线至少 6 个点， 包括 LLOQ （标准曲线最低浓度）

　、 ULOQ （最高浓度）

　Upper limit of quantification 2.

　 精密度 precision 和准确度 accuracy：

　三个浓度， 每个浓度进样 5 次， 测定与理论差≤15% 、 LLOQ 外≤20%。

　三个浓度的分布要求：

　lowQC sample=3*LLOQ middleQC=中间点 highQC 接近曲线最高点 3.

　 稳定性：

　2 个浓度的三次冻融 （每个 2 次？ ）

　 生物样品的室温稳定性、 处理后的稳定性。

　分析数据的可接受标准 1.

　 标准曲线除 LLOQ， CV 在 15%以内 2.

　 QCsample 在分析过程中合理分布 3.

　 QCsample 至少 67%-->

　<15%

　 最多 33%-->

　 >15%可接受 4.

　 每样品周期中 QC 样品至少 5%

　 中药指纹图谱方法验证评价标准

　CSV 图谱? 参数：

　精密度、 重现性、 稳定性 方法：

　相似度软件 要求：

　相似度>0.9

　or

　0.95

　 建立实验室的 SOP 标准操作规程

　SOP 标准操作作业书

　SOP 内容：

　原始记录保存

　 试剂

　 安全

　 仪器

　 样品传递过程控制

　设备

　样品标签

　 质量控制

　 方法

　 结果保证

篇六：方法学验证指导原则

　 有关物质分析方法验证的可接受标准简介

　 CDE 黄晓龙

　 摘要：本文介绍了在对有关物质检查所用的分析方法进行方法学验证时，各项指标的可接受标准，以利于判断该分析方法的可行性。

　 关键词：有关物质检查 分析方法验证 可接收标准

　 药品中的有关物质泛指在药品的生产与储存过程中产生的工艺杂质或降解产物。由于这些有关物质的存在会影响到药品的纯度，进而可能会产生毒副作用，所以有关物质的控制是药品研发的一个重要方面，也是我们在药品审评中一直重点关注的要点之一。而要对有关物质进行严格的控制，就离不开专属性强、灵敏度高的分析方法，这就涉及到分析方法的筛选与验证。从现有的申报资料看，药品研发单位已基本上意识到分析方法验证的重要性，但是对验证时各具体指标是否可行尚没有一个明确的可接受标准，从而难以对验证结果进行评判。为解决这一问题，本文结合国外一些大型药品研发企业在此方面的要求，提出了在对有关物质检查方法进行验证时的可接受标准，供国内的药品研发单位在进行研究时参考。

　 1．准确度

　 该指标主要是通过回收率来反映。验证时一般要求根据有关物质的定量限与质量标准中该杂质的限度分别配制三个浓度的供试品溶液各三份（例如某杂质的限度为 0.2%，则可分别配制该杂质浓度为 0.1％、0.2％和 0.3％的杂质溶液），分别测定其含量，将实测值与理论值比较，计算回收率，并计算 9 个回收率数据的相对标准差（RSD）。

　 该项目的可接受的标准为：各浓度下的平均回收率均应在 80%-120%之间，如杂质的浓度为定量限，则该浓度下的平均回收率可放宽至 70%-130%，相对标准差应不大于 10%。

　 2．线性

　 线性一般通过线性回归方程的形式来表示。具体的验证方法为：

　 在定量限至一定的浓度范围内配制 6 份浓度不同的供试液，分别测定该杂质峰的面积，计算相应的含量。以含量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归分析。

　 可接受的标准为：回归线的相关系数（R）不得小于 0.990，Y 轴截距应在 100％响应值的 25％以内，响应因子的相对标准差应不大于 10%。

　 3．精密度

　 1）重复性

　配制 6 份杂质浓度（一般为 0.1%）相同的供试品溶液，由一个分析人员在尽可能相同的条件下进行测试，所得 6 份供试液含量的相对标准差应不大于 15%。

　 2）中间精密度

　 配制 6 份杂质浓度（一般为 0.1%）相同的供试品溶液，分别由两个分析人员使用不同的仪器与试剂进行测试，所得 12 个含量数据的相对标准差应不大于 20%。

　 4．专属性

　 可接受的标准为：空白对照应无干扰，该杂质峰与其它峰应能完全分离，分离度不得小于 2.0。

　 5．检测限

　 杂质峰与噪音峰信号的强度比应不得小于 3。

　 6．定量限

　 杂质峰与噪音峰信号的强度比应不得小于 10。另外，配制 6 份最低定量限浓度的溶液，所测 6 份溶液杂质峰保留时间的相对标准差应不大于 2.0%，峰面积的相对标准差应不大于5.0%。

　 7．耐用性

　 分别考察流动相比例变化±5％、流动相 pH 值变化±0.2、柱温变化±5℃、检测波长变化±5nm、流速相对值变化±20％以及采用三根不同批号的色谱柱进行测定时，仪器色谱行为的变化，每个条件下各测试两次。可接受的标准为：各杂质峰的拖尾因子不得大于2.0，杂质峰与其他成分峰必须达到基线分离；各条件下的杂质含量数据（n=6）的相对标准差应不大于 2.0%，杂质含量的绝对值在±0.1％以内。

　 8、系统适应性

　 配制 6 份相同浓度的杂质溶液进行分析，该杂质峰峰面积的相对标准差应不大于 2.0%，保留时间的相对标准差应不大于 1.0%。另外，杂质峰的拖尾因子不得大于 2.0，理论塔板数应符合质量标准的规定。

　 9．溶液稳定性

　 按照分析方法分别配置对照品溶液与供试品溶液，平行测定两次主成分与杂质的含量，然后将上述溶液分别贮存在室温与冰箱冷藏室（4℃）中，在 1、2、3、5 和 7 天时分别平行测定两次主成分与杂质的含量。

　 可接受的标准为：主成分的含量变化的绝对值应不大于 2.0%，杂质含量的绝对值在±0.1％以内，并不得出现新的大于报告限度的杂质。

　含量测定分析方法验证的可接受标准简介

　 审评四部 黄晓龙

　 摘要：本文介绍了在对含量测定所用的分析方法进行方法学验证时，各项指标的可接受标准，以利于判断该分析方法的可行性。

　 关键词：含量测定 分析方法验证 可接收标准

　 在进行质量研究的过程中，一项重要的工作就是要对质量标准中所涉及到的分析方法进行方法学验证，以保证所用的分析方法确实能够用于在研药品的质量控制。为规范对各种分析方法的验证要求，我国已于 2005 年颁布了分析方法验证的指导原则。该指导原则对需要验证的分析方法及验证的具体指标做了比较详细的阐述。但是文中未涉及各具体指标在验证时的可接受标准，国际上已颁布的指导原则中也未发现相关的要求。另一方面，大多数药品研发单位在进行质量研究时，已逐步认识到分析方法验证的必要性与重要性，大都也在按照指导原则的要求进行分析方法验证，但验证完后却因没有一个明确的可接受标准，而难以判断该分析方法是否符合要求。本文结合国外一些大型药品研发企业在此方面的要求，提出了在对含量测定方法进行验证时的可接受标准，供国内的药品研发单位在进行研究时参考。

　 1．准确度

　 该指标主要是通过回收率来反映。验证时一般要求分别配制浓度为 80％、100％和120％的供试品溶液各三份，分别测定其含量，将实测值与理论值比较，计算回收率。

　 可接受的标准为：各浓度下的平均回收率均应在 98.0%-102.0%之间，9 个回收率数据的相对标准差（RSD）应不大于 2.0%。

　 2．线性

　 线性一般通过线性回归方程的形式来表示。具体的验证方法为：

　 在 80％至 120％的浓度范围内配制 6 份浓度不同的供试液，分别测定其主峰的面积，计算相应的含量。以含量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归分析。

　 可接受的标准为：回归线的相关系数（R）不得小于 0.998，Y 轴截距应在 100％响应值的 2％以内，响应因子的相对标准差应不大于 2.0%。

　 3．精密度

　 1）重复性

　 配制 6 份相同浓度的供试品溶液，由一个分析人员在尽可能相同的条件下进行测试，所得 6 份供试液含量的相对标准差应不大于 2.0%。

　2）中间精密度

　 配制 6 份相同浓度的供试品溶液，分别由两个分析人员使用不同的仪器与试剂进行测试，所得 12 个含量数据的相对标准差应不大于 2.0%。

　 4．专属性

　 可接受的标准为：空白对照应无干扰，主成分与各有关物质应能完全分离，分离度不得小于 2.0。以二极管阵列检测器进行纯度分析时，主峰的纯度因子应大于 980。

　 5．检测限

　 主峰与噪音峰信号的强度比应不得小于 3。

　 6．定量限

　 主峰与噪音峰信号的强度比应不得小于 10。另外，配制 6 份最低定量限浓度的溶液，所测 6 份溶液主峰的保留时间的相对标准差应不大于 2.0%。

　 7．耐用性

　 分别考察流动相比例变化±5％、流动相 pH 值变化±0.2、柱温变化±5℃、流速相对值变化±20％时，仪器色谱行为的变化，每个条件下各测试两次。可接受的标准为：主峰的拖尾因子不得大于 2.0，主峰与杂质峰必须达到基线分离；各条件下的含量数据（n=6）的相对标准差应不大于 2.0%。

　 8、系统适应性

　 配制 6 份相同浓度的供试品溶液进行分析，主峰峰面积的相对标准差应不大于 2.0%，主峰保留时间的相对标准差应不大于 1.0%。另外，主峰的拖尾因子不得大于 2.0，主峰与杂质峰必须达到基线分离，主峰的理论塔板数应符合质量标准的规定。

篇七：方法学验证指导原则

　生物样品分析 ; 方法学验证 ; 方法学质控生物样品分析方法的建立、 验证和应用是临床前药动学和Ⅰ期临床试验研究中的重要组成部分 , 关系到药动学研究和生物等效性试验研究的科学性和正确性。其中 , 方法学验证(Met hod validation) 是整个试验数据可靠的基本保证 ,因此其是各个实验室标准操作规程(SOP) 的重点内容。本文根据国际上有关生物分析方法验证的指导原则 , 参照我国国家食品药品监督管理局的管理规范 , 结合本实验室研究经验 , 总结了以色谱分析方法为主的生物样品分析中方法学验证的内容及其标准制定中有待发展的方向 ,以供同行交流参考。1 意义方法学验证 ,又称方法学评价、方法学确认等 ,是整个药动学、生物利用度及生物等效性研究的基础。

　这是药动学研究有别于其他药理毒理研究的特殊之处。

　所有药动学研究结果都依赖于生物样品的测定 , 只有可靠的方法才能得出可靠的结果。

　在通过特异性、 灵敏度、 精密度、准确度、 稳定性等研究并建立检测方法学 , 以及得到了标准曲线后 , 在检测过程中还应进行方法学质控 , 制备随行标准曲线并对质控样品进行测定 , 以确保检测方法的可靠性。2 分类及其应用范围按照美国食品与药品管理局分 ( FDA) 类,方法学验证分为全面验证 ( Full validation) 、部

　分验证 (Partial validation) 和交叉验证 (Cross validation) [1 ] 。211 全面验证对于一个本质上的新药的分析方法 , 以及对首次建立的分析方法需要进行全面的分析方法的验证 , 对代谢物进行定量分析的时候也要考虑到进行全面的分析方法的验证。212 部分验证已经经过验证的分析方法变更时可考虑做部分分析方法的验证 , 部分验证的内容可以根据分析方法变更的程度从只进行日内精密度和准确度的考察到接近全面的分析方法的考察 ,实际操作中要结合实际情况 ,以达到客观、严谨的科研目的 ,确定部分方法学验证的内容。部分方法学验证经常见于如检测方法的改变 ; 血浆样品采集中抗凝剂的改变 ; 同一种属的生物基质变化 (例如人的血浆改变为人的尿液 ) ; 同一基质的不同种属变化 (例如大鼠血浆到犬血浆) ; 相关线性浓度范围的变化 ; 分析仪器或分析软件工作站的改变 ; 样品采样量的限制而造成的分析方法过程中的变动 ( 例如儿科中的药动学研究 ) ; 联合用药或特殊的代谢产物影响分析方法的选择性而需要调整色谱条件等情况的分析方法。213 交叉验证比较两个分析方法的验证参数。

　常用于同一物质的不同分析方法的改变 , 如从高效液相色谱法到液质联用的变化或两个及两个以上实验室对同一物质按同一方案进行分析时 [2 ] 。3 内容分析方法中色谱方法比较常用 , 在色谱方法中方法学验证有以下内容 [1 ,3 ] : 311 特异性特异性 (Selectivity) 要求至少 6 个不同个体的空白样品无干扰 , 并要求提供空白生物样品色谱图、 空白生物样品加对照物质色谱图、 用药后的生物样品色谱图。

　如果采用内标方法 ,还需要提供空白生物样品加内标物质色谱图 , 以证明内标中所含杂质不干扰待测药物的分析。312 线性31211 线性范围确定根据生物样品中药物浓度范围 , 确定线性范围。建立标准曲线时应随行空白生物样品 , 但计算时不包括该点。标准曲线至少有不包括空白在内的 6 个点。定量范围应能覆盖全部待测浓度 , 不允许将定量范围外的浓度推算为未知样品的浓度。31212 相关系数与反算浓度通过系列浓度的标准生物样品进行测定 , 得到浓度与响应值的回归方程。

　对于标准曲线

　的要求除相关系数 ( r) 值大于 0199 外 ,还要求经标准曲线反算浓度要在真实浓度的±15 % 范围内 , 标准曲线最高点和最低点在 ±20 % 范围内。为保证生物分析数据的质量 , 采用何种算法建立标准曲线尤为重要 , 分析方法委员会 (Analytical met hodscommit tee) 推荐使用加权回归方程检查标准曲线的线性 (Linear range) 。与普通最小二乘法不同的是加权最小二乘法 (Weighted least squares) 在回归计算时增加了 1 个权重因子 W , 采用这种方法计算回归直线的斜率和截距 , 可使生物样品的测定结果与理论值的相对偏差在不同的浓度区间内比较均衡 [4 ] 。对于测定浓度范围特别宽的少数情况下 , 可采用不同浓度区间 2 条回归直线组合的方法。31213 标准曲线各个点的取舍标准曲线的浓度范围和浓度点一经确定 , 在每个分析批次 (Batch) 中, 不能为了达到以上对于线性的要求而对标准曲线各个组成点作舍弃处理。

　只有当标准曲线中某点的反算浓度超过真实浓度的 15 % , 才能作舍弃处理 , 并要保证舍弃后标准曲线至少包括 6 个点。标准曲线最高点和最低点不能作舍弃。31214 最低定量限 (LLOQ) 定量下限是标准曲线的最低浓度点。

　LLOQ 的确定应该测定至少 5 个样品 ( 不包括标准曲线中的最低浓度点 ) , 保证在真实浓度的 80 % ～120 % 内, 变异系数 (CV) 不得超过20 % , 并且信噪比应大于 5 。LLOQ 区别于检测限 (Detection limit ) , 检测限只要求信噪比为 3 。313 精密度与准确度31311 质控样品浓度确定一般采用 3 个浓度的质控样品 ,低浓度接近定量下限 , 在定量下限的 3 倍以内 ; 高浓度接近标准曲线的上限 (一般为高浓度的 80 %) ; 中间选择一个浓度 , 每一浓度至少 5 个样品。

　目前 , 国际杂志上有些论文中质控样品浓度的选择为标准曲线的最低点、 最高点和中间浓度。31312 精密度 (Precision) 用质控样品的批内和批间相对标准差 ( RSD) 表示 , RSD 一般应小于 15 % , 在 LLOQ 及最高定量限 (ULOQ) 附近 RSD 应小于 20 % 。一日内每隔 2 h 处理一组低、中、高浓度样品 ,共处理 5 组,来计算日内精密度。

　获得批间 ( 日间 ) 精密度应至少连续测定 3 个分析批次 ,一般为 5 个分析批次 ,每个浓度至少测定 3 个样品。

　31313 准确度 (Accuracy) 指测定生物样品浓度与真实浓度的接近程度 ,用 REC( %) 表示 ,一般要求应在 85 % ～115 % 内,在 LLOQ 及 ULOQ 附近 REC 应在 80 % ～120 % 内。314 稳定性根据具体情况 , 对分析过程中所涉及到的预处理前、预处理中及预处理后的样品在不同基质、不同放置条件下及不同存放时间进行稳定性 (Stabilit y) 验证 , 以排除外界因素对测定结果的影响 , 保证分析结果的客观性。一般主要考察以下几个方面 : 31411 贮备液 (Stock solution ) 稳定性验证贮备液在特定溶媒、特定保存温度下 ( 一般 2 个温度 ,室温和冷藏 ) 、不同放置时间的稳定性 , 以确定贮备液的保存条件和保存日期。

　经过特定贮存条件的贮备液浓度与新配制的贮备液浓度的偏差 ( % ,Difference) 不超过 5 % 。偏差 = ( 新配制贮备液峰面积 — 稳定性考察的贮备液峰面积 ) / 新配制贮备液峰面积 ×100 % 。因为所测定的样品是溶媒中而非生物基质中 , 故其可接受标准为 5 % 。31412 待测药物在生物样品中的稳定性冷冻解融稳定性指制备好的质控样品经过 3 个循环的冷冻解融时的稳定性变化情况。质控样品冷冻保存 24 h , 放置于室温 ,自然解融至室温 ,然后再冷冻 12 ～24 h , 称为一个冷冻解融循环。短期放置稳定性指验证样品在生物介质中室温放置 4～ 12 h 的稳定性 , 一般采用室温 4 h 。长期冷冻放置稳定性放置时间的设置根据实验中样品采集到样品分析的可能的时间间隔 , 一般采用 2 、 4 、8 周。31413 处理好样品 (Processed samples) 稳定性一般指处理好的样品置于自动进样器到进样时间段样品的稳定性。

　如果自动进样器不能进行温度控制 , 一般考察处理好样品放置于室温 24 h 的稳定性 ; 如果自动进样器可控制温度 , 则考察设置温度下处理好样品 24 h 的稳定性。在该项验证中需要注意的是 ,如采用内标法 , 则内标的稳定性也需要同时进行考察。在稳定性考察中 , 每项考察采用低、中、高3 个浓度样品 , 每个样品平行操作 3～5 份, 其可接受标准定为每个浓度中 67 % 的样品与真实浓度的偏差不超过 15 % 。偏差 = ( 真实浓度 —稳定性考察样品的测得浓度 ) / 真实浓度×100 % 。315 稀释中国药房 2008 年第 19 卷第 31 期 China Pharmacy 2008 Vol . 19 No . 31 · 2471 ·超出线性范围的样品可采用稀释 (Dilution) 的方法 , 但是必须对该项进行验证 ,采用相同基质

　进行稀释 , 最少平行操作 6 份 , 并保证 67 % 的样品稀释后的测定浓度在真实浓度的85 % ～ 115 % 内。316 基质效应按照美国临床实验室标准化委员会的定义 , 基质效应 (Mat rix effect ) 指样品中除目标分析物以外的其它成分对待测物测定值的影响 , 即基质对分析方法准确测定分析物能力的干扰。在采用质谱方法进行体内药物定量检测时 , 应进行基质效应试验 ,观察基质对药物测定的影响。317 残留效应在方法评价中 , 线性的最高浓度被测试之后 , 必须测试试剂空白样品来评价残留效应(Carryover evaluation) 。其可允许接受的范围为小于 LLOQ 的 20 % 。318 保留时间选定一个浓度的样品 , 选择不同日期或者不同批次的保留时间 (Retention ,采用内标时用两者比值 ) 测定出其平均值。每个批次中样品的保留时间应在此平均值的 85 % ～115 %内。4 方法学质控生物样本分析方法验证完成之后才能开始测定未知样品。

　在测定生物样品中的药物浓度时应进行质量控制 , 以保证所建立的方法在实际应用中的可靠性。

　质量控制内容及相关问题主要涉及以下几个方面 : 411 系统适应性批次的开始应有一系统适应性 (System suitability test ,SST) 样品 , 一般用相当于标准曲线中间浓度峰面积的无基质样品 (溶剂中或流动相中 ) 来评价柱子理论塔板数、分离度和保留时间等。412 质控样品数量及可接受标准方法学应用中的精密度和准确度需要进行监测 , 为达到此目的需要设定一定数量的质控样品。质控样品的数量根据每个批次的样品总的数量决定 , 一般要求质控样品数大于未知样品总数的 5 % , 并遵循 4 ∶6 ∶20 原则 , 即 6 个质控样品中至少有 4 个样品的浓度与真实值偏差在 20 % , 且超出 20 % 的样品不是同一浓度。根据此原则来决定所分析批次是否被接受。413 标准曲线的拟订方法学应用中的标准曲线拟合 , 权重系数选择和拟合优度要和方法学建立过程中的方法学

　验证保持一致。414 重复分析当色谱分析数据与药动学规律存在矛盾 , 色谱行为差、仪器故障、序列问题 ,或者其他目的的时候 ,分析样品的批次需要进行重复分析。这种重复分析是允许的 , 但是必须记录原始数据和重复分析后的数据 ,并详细注明重复分析的原因。415 分析批次的舍弃处理由于质控样品不符合 4 ∶6 ∶20 原则或保留时间不符合要求等原因 ,批次应作舍弃处理 ,该组数据不纳入数据分析 ,但是必须记录舍弃该数据的原因。5 注意问题511 方法学验证的内容要根据实际情况制定在实际操作中 , 每个试验项目都有其自身的特殊性 , 方法学验证的具体内容要根据具体情况制订 , 首先要考虑到确保方法的科学性和客观准确性 , 其次也要考虑到经济原因、时间因素等。512 生物样品分析方法验证中存在的风险 [5 ]方法学验证的目的是为了达到客观准确的分析结果 , 通过外标已知浓度的样品 (Spiked samples) 对生物样品离体后在采集、运输、储藏、处理、进样分析过程中可能遇到的情况进行考察 , 以保证在测定未知浓度的生物样品时实验结果的可靠性。

　但是外标样品 , 即在相同的空白生物基质中加入已知浓度的标准品 , 与实验动物或受试者给药后的真实的生物样品 (Real samples) 之间可能存在差异 , 这些差异主要存在以下几个方面 : (1) 稳定性的改变 ; (2) 回收率的改变 ,外标样品和真实样品的回收率不同 ; (3) 不稳定代谢物的存在及其对测定结构的影响 ; (4) 存在结构类似 (色谱行为接近 ) 的代谢产物 ,外标样品不能充分考察其分离度 ; ( 5) 基质效应的影响 ; (6) 蛋白结合率的影响。因为这些差异的存在 ,会影响分析测定数据的客观性 ,因此在实际应用中 , 应充分考虑可能存在的影响因素 , 建立完善的方法学验证的内容 ,保障测定结果准确可靠。6 方法学验证及考核标准的发展方法学验证中各项考察标准的建立已经非常成熟 , 并在药动学研究中得到广泛应用 , 但是在应用过程中 , 方法学验证的标准也应该不断完善。

　对外标样品是否能充分代表真实样品也应该给予重视 , 并建立对应的考察评价标准。

　建立严密客观的方法学验证的标准是药动学研究的基础 , 是获得科学客观结果的基本保障。参考文献

　Bioanalyt ical Method...

篇八：方法学验证指导原则

　 张双庆 * ， 范玉明 *（中国食品药品检定研究院， 北京 100176）摘 要：本文对生物大分子药物生物分析方法的全面验证、部分验证、交叉验证和真实样品分析等方面进行阐述。关键词：

　生物大分子药物； 生物分析方法； 验证中图分类号：Q5　　　文献标识码：A　　　　文章编号：1001-8751(2012)05-0199-05 Bioanalytical Method Validation for Macromolecules: Interpretation of Guideline of European Medicines AgencyZhang Shuang-qing,

　Fan Yu-ming

　（National Institutes for Food and Drug Control,

　Beijing

　 100176）Abstract:

　The review covers full validation, partial validation, cross-validation and incurred sample analysis aspects of bioanalytical method for macromolecules.Key words：macromolecule;

　bioanalytical method;

　 validation收稿日期：2012-08-20基金项目：人力资源和社会保障部留学人员科技活动择优项目资助。*，通讯作者：张双庆， 博士，

　副研究员，

　研究方向：药代动力学和药剂学。

　 范玉明，

　副研究员，

　研究方向：药理学与毒理学。

　 .

　血清、血浆、全血、尿液、唾液和组织等生物基质中药物浓度测定是药物研发的重要环节，用于评价和阐述药代动力学、毒代动力学、生物等效性、生物利用度等研究，为药物安全性和有效性评价提供科学依据，因此所用生物分析方法的建立和验证对于获得可信实验结果至关重要。欧洲药品管理局（European Medicines Agency，EMA）2012年2月1日开始正式实施《生物分析方法验证指导原则》（Guideline on bioanlytical method validation, EMEA/CHMP/EWP/192217/2009），分别就小分子化学药物和大分子生物药物的生物分析方法验证进行规定，小分子和大分子药物差异较大（见表1）。该指导原则首次全面、明确提出了生物大分子药物分析方法验证的指标和接受标准，2015版中国药典草案已采用该指导原则 [1] 。国家食品药品监督管理局药品审评中心2005年颁布的《化学药物非临床药代动力学研究技术指导原则》、《化学药物临床药代动力学研究技术指导原则》和《化学药物制剂人体生物利用度和生物等效性研究技术指导原则》，以及2010版《中国药典》II部附录XIX B《药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验指导原则》对小分子化学药物的生物分析方法验证已有详细规定，而对大分子生物药物的生物分析方法验证却未涉及，故本文仅对大分子生物药物的生物分析方法验证作一介绍。酶联免疫吸附分析、放射免疫分析和时间分辨荧光免疫分析等配体结合分析法常用于大分子生物药物分析，但配体结合分析法与测定小分子化学药国外医药抗生素分册

　2012年9月第33卷第5期DOI:10.13461/j.cnki.wna.004600

　 . 200 .

　物的色谱法明显不同，如标准曲线通常非线性且浓度范围窄、精密度范围大、待测物所用试剂特异性强、分析待测物无需从生物基质中分离、不需要内标化合物等 [4] 。本文从全面验证、部分验证、交叉验证和真实样品分析等方面对生物分析方法验证进行阐述。1 全面验证1.1

　对照品方法学验证和真实样品分析时，药物加到空白生物基质中混合制备标准样品、质控样品及稳定性样品，因此药物对照品的质量非常重要。大分子生物药物由细胞培养而得，效价和免疫反应性批间差异很大，多数情况下没有真正意义上的“纯”大分子药物对照品。这就要求制备标准样品、质控样品的对照品与临床前和临床给药的对照品为同一批次。变换批次时，对照品使用前要进行分析鉴别以及生物分析评价来确证分析方法没有改变 [2] 。1.2

　特异性特异性是指结合剂在生物基质中有其它内源或外源物时，仅与待测物结合的能力。理想的结合剂应有特异性，与内源物、异构体、有相似表位的翻译后修饰变体、理化性质相似物等“有关物”及预期的联合使用药物不发生交叉反应性。方法建立和验证时，这些“有关物”不容易获得，通常完成初步验证获得更多药物信息后再开展特异性研究。将“有关物”或预期联合使用的药物加到空白基质中，制备定量下限（LLOQ）和定量上限（ULOQ）浓度的大分子药物质控样品评价方法特异性。质控样品准确度应在理论浓度的25%以内。非特异性分为固有非特异性和非固有非特异性，固有非特异性即交叉反应性，非固有非特异性即基质效应。用含有离液剂或螯合剂的缓冲液稀释生物基质可以减少甚至消除非固有非特异性，即最少必要稀释 [2, 5] 。1.3

　选择性选择性是指基质中存在无关物时，配体结合分析法测定药物的能力。由于大分子固有特性，生物样品不需要分离提取，这就使得基质中的异嗜性抗体、类风湿因子、蛋白酶等无关物可能干扰测定。采用包括脂血和溶血生物基质在内的至少10个来源基质评价选择性，有条件的话最好也用有关患群的生物基质。通常在LLOQ处或附近评价选择性，高浓度应谨慎选择。如果干扰与药物浓度有关，就需要确定干扰处的最低浓度，分析方法验证前调整LLOQ数值。至少80%来源样品的准确度在理论浓度的20%内（LLOQ处为25%）。

　表1 小分子化学药物和大分子生物药物特性比较 [2-3]

　Table 1 Comparison of the characteristics of small-molecule and macromolecule compounds特性(characteristic)小分子(small molecules)大分子(macromolecules)分子量(size)较小（&lt; 1000 Da）(small)较大（&gt; 5000 Da）(large)结构(structure)有机分子(organic molecules)氨基酸生物高聚物；多聚体(amino acid biopolymers; could be multimeric)纯度(purity)同源(homogeneous)异源(heterogeneous)溶解度(solubility)通常疏水(often hydrophobic)通常亲水(often hydrophilic)稳定性(stability)化学方面(chemical)化学、物理和生物方面(chemical, physical and biological)生物基质中存在形式(presence in matrix)外源性(xenobiotic)内源性(endogenous)合成(synthesis)有机合成(organic synthesis)生物途径(biological production)代谢(metabolism)有规定(def i ned)未有明确规定，取决于环境及体内条件而发生生物转化(not well def i ned; could be biotransformed depending on the environment as well as in vivo conditions)血清结合(serum binding)白蛋白(albumin)特异载体蛋白(specif i c carrier proteins)World

　Notes

　on

　Antibiotics, 2012,Vol.33, No.5

　. 201 .1.4

　残留效应配体结合分析过程中如使用自动分注系统，有可能出现残留效应。一份高浓度样品或ULOQ标准样品后放置一份空白样品来考察基质效应，空白样品中的残留量不应超过LLOQ的20%。如残留效应无法避免，真实样品测定时不可随机放置，通常在高浓度样品后放置空白样品，然后再放置下一个样品。1.5

　基质选择由于基质中结构类似的内源物强烈干扰，某些生物大分子如不用提取的方法则无法进行分析。不推荐使用提取基质（如活性炭、免疫吸附处理）和替代基质（如蛋白缓冲液、透析血清）替代生物基质，但如无其他方法定量分析，则只能使用这些基质。这种情况下，标准曲线浓度点应使用这些基质配制，但质控样品需用实际样品基质配制，计算准确度保证没有基质效应。1.6

　最少必要稀释最少必要稀释是样品用缓冲液稀释的最小倍数，从而将基质较高的背景信号干扰降低到噪音水平，保证精密度和准确度。加样样品应使用与用于最小必要稀释测定的真实样品同样的基质配制。如标准样品用100%基质配制，则无需最少必要稀释，真实样品也无需稀释。即由于基质效应，内源物不产生线性信号或观察到背景信号，则真实样品必须稀释 [2] 。1.7

　标准曲线标准曲线最好现配现用，如果药物稳定，则可以使用预先配制的贮备液。标准曲线至少有6个浓度点，每个浓度至少2个样品，应提供至少6条标准曲线。标准样品浓度应在对数浓度范围内均匀分布，标准曲线浓度范围外应使用定位点来判别模型，但定位点不计入标准曲线。由于操作失误等技术问题（如加样错误）可以将某个浓度点剔除，但其他原因剔除的标准样品浓度应不改变回归模型。标准曲线各浓度点的实测值与理论值之间的偏差在可接受的范围之内时，可判定标准曲线合格。可接受范围一般规定为LLOQ和ULOQ的偏差在25%以内，其余浓度点的偏差在20%以内，至少75%标准样品浓度符合该标准，且必须包括LLOQ和ULOQ。标准曲线回归模型不是由模型相关系数决定，而是由反算浓度与理论浓度间的百分偏差最小来确定。回归模型通常为4参数对数模型，如标准曲线不对称，则采用5参数模型。当线性范围较宽的时候，采用加权的方法对标准曲线进行计算，适宜权重可以减少LLOQ和ULOQ处浓度偏差 [5-6] 。1.8

　准确度和精密度准确度（系统误差，平均误差）是指在确定的分析条件下，测定的生物样品浓度与理论浓度的接近程度，表示成相对理论浓度的百分数。精密度（随机误差，变异）是指在确定的分析条件下，相同基质中同浓度样品的多个测量值的离散度。用于准确度和精密度的质控样品不应现配，而应采用与分析的真实样品同样方式冻存和处理。质控样品应使用与配制标准曲线不同的贮备液配制。至少LLOQ、低浓度（3倍LLOQ内），中浓度（标准曲线几何中间浓度），高浓度（75%-85% ULOQ）、ULOQ 五个浓度质控样品来考察分析方法的准确度、精密度和总误差。验证过程应与分析过程一致，即每个样品测定两次时，质控样品测定两次（复孔）。由于配体结合分析法的批间变异通常大于批内变异，故应提供不同时间至少6批样品的批内和批间准确度和精密度。批内和批间的准确度不超过20%，LLOQ和ULOQ处不超过25%；批内和批间的精密度不超过20%，LLOQ和ULOQ处不超过25%。而且，总误差（相对误差绝对值和变异系数之和，RE+CV）不超过30%，LLOQ和ULOQ处不超过40%。总误差描述了系统误差（计算值与理论值间的偏差）和随机误差（计算值与测定平均值间的偏差）之和 [2] 。1.9

　稀释线性样品浓度超过ULOQ时，需用空白生物基质将样品稀释到标准曲线范围内准确测定，要用质控样品来验证稀释线性。而且，要进行稀释实验来检测可能的钩状效应，即药物浓度过高导致的信号强度抑制效应。钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时，应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。每一稀释度的反算浓度准确度应在理论浓度的20%内，精密度不超过20%。1.10

　平行性平行性与稀释线性的区别在于平行性使用真实样品来验证 [2,7] ，而稀释线性使用加样质控样品。高国外医药抗生素分册

　2012年9月第33卷第5期

　 . 202 .

　浓度真实样品（最好接近C max ）用空白基质稀释至少3倍，评价基质效应或对代谢物的不同亲和性。稀释样品的精密度不应超过30%。1.11 稳定性稳定性研究用于保证样品采集、贮存、制备和分析等过程中不影响样品浓度测定。稳定性研究的每一步应与真实样品条件一致，如样品基质、抗凝剂、容器材质、贮存和分析条件。仅有参考发表文献数据是不够的。稳定性包括贮备液和工作液稳定性、样品冻融稳定性、样品室温稳定性、样品长期稳定性、样品制备后室温稳定性等。使用低（3倍LLOQ内）、高（75%-85% ULOQ）2个浓度质控样品考察稳定性，每一浓度偏差不应超过理论浓度的20%。贮备液和工作液稳定性中无需考察每一浓度，只需考察高低浓度即可。样品冻融稳定性中冻融次数应等于或超过真实样品冻融次数，每次冻存至少12 h。样品长期稳定性中真实样品的每一贮存温度都要验证，这与小分子化学药物只需验证高低温度不同。1.12

　其它问题几份制药行业操作标准详细叙述了生物大分子药物生物分析方法验证 [2,5-8] ，其中还涉及了耐用性（Robustness）、稳健性（Ruggedness）和关键试剂等问题。耐用性和稳健性是为了考察在标准实验室条件下，实际分析条件稍有变动时，方法可否很好进行分析。耐用性是考察影响分析的变动出现时，测定结果的一致性，如免疫分析中的孵育时间、孵育温度、曝光时间、生物基质等。稳健性是不同操作条件时分析的一致性，如不同分析人员、仪器、批量、分析时间等。结合试剂（如结合蛋白、适体、抗体、结合抗体）和含酶试剂等对分析结果有直接影响的关键试剂批次变化时，要验证方法确保与前一批次测定结果没有变化。2

　部分验证已全面验证的生物分析方法稍有改变时，无需再次全面验证。部分验证可以从只进行批内（日内）准确度和精密度验证到几乎全面验证。实验室或分析者间分析方法移交、分析仪器或软件操作系统改变、标准曲线范围改变、抗凝剂改变、同种属动物间基质改变（如从人血浆变为人尿液）、同基质间动物种属变化（如大鼠血浆变为小鼠血浆）、样品处理方法改变、样品贮存条件、样品体积有限（如儿童研究中）、稀有基质、联合用药或特定代谢产物时待测药物选择性验证等需要开展部分验证。3

　交叉验证同一实验室采用不同分析方法或不同实验室采用相同分析方法获得的数据，需要比较数据且对分析方法要进行交叉验证。尽可能在研究样品分析前开展交叉验证，需采用两种分析方法分析相同的质控样品或真正样品。对质控样品而言，两种分析方法准确度应在15%以内；对...

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